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= externe Verbindungen
Die Vorhersage dreidimensionaler (3D) Proteinstrukturen aus ihren Aminosäuresequenzen ist ein typisches Beispiel für das bereits auf biomolekularer Ebene auftretende Komplexitätsproblem, welches noch weit von der strukturellen und funktionellen Komplexität von Zellen und Zellsystemen entfernt ist. Genaue Vorhersagen der Proteinstruktur aus Aminosäuresequenzen sind auch nach über 30 Jahren intensiver Forschung und trotz der explosiven Entwicklung von Hard- und Softwarekapazität in der Zwischenzeit. immer noch schwierig.
Alternativ repräsentiert die von unten nach oben gerichtete Vorgehensweise der molekularen Einzelzellphänotypanalyse ganzer Zellsysteme (Zytomik) als molekulare Zellsystemforschung eine Art vielschichtiger reverse engineering Strategie zur induktiven Komplementierung (fig.1) deduktiver Vorgehensweisen. Auf diese Weise kann ein standardisiertes relationales Rahmenwerk direkt krankheitsbezogener molekularer Wechselbeziehungen etabliert und anschließend mit den erforderlichen Details komplementiert werden.
Das Konzept der
Prädiktivmedizin mittels
Zytomik
(L1-L3) wurde als Konsequenz
aus diesen Überlegungen entwickelt. Es führte
kürzlich
zu
Gedanken
über ein menschliches Zytomprojekt, die
Interesse
(
siehe Details)
gefunden haben.
Die anhaltende Entwicklung neuer bild- und durchflußzytometrischer Instrumentation, wie konfokale oder Laserscanning Mikroskopie mit Mehrfarbenbandpass- oder spektraler Bildgebung, Multiphotonenfluoreszenzanregung, Fluoreszenzenergietransfer (FRET), schnelle durchflußzytometrische Fluoreszenzbildaufnahme, optische Zelldehnungsmessung im Durchfluß, miniaturisierte Durchflußzytometrie auf Laborchips oder die Lasermikrodissektion von Geweben stellt einen erheblichen Fortschritt für die molekulare Einzelzellanalyse dar. Biomolekulare Analysetechniken, wie Partikelmatrixanalyse (bead arrays), Einzelzell-Polymerasekettenreaktion (PCR), Tyramid-Signalamplifikation, oder Biomolekülmarkierung durch Quantumdots, magnetische Nanopartikel und Aptamere eröffnen neue Horizonte der molekularen Spezifität und Sensitivität.
Die Dimensionalität von Zelldaten kann bei der Erhebung vielschichtiger molekularer Zellprofile erheblich sein z.B. bei der wiederholter Anwendung von Vielfarben-Fluoreszenzfärbeprotokollen in Gegenwart von zahlreichen unterschiedlichen Zellpopulationen. Zunächst können mehrere Zellfunktionen vitaler Zellen, wie z.B. intrazellulärer pH-Wert, Transmembranpotentiale oder Ca2+-Spiegel angefärbt werden, gefolgt von Zellfixation zur Beseitigung der Vitalfärbungen und Anfärbung intrazellulärer Bestandteile, wie Antigene, Lipide oder Kohlenhydratstrukturen. Nach erneuter Entfärbung können spezifische Nukleinsäuren gefärbt werden. Mikroskopische Bildaufnahme- und Analysegeräte mit ihren Relokalisierungsmöglichkeiten werden zunehmend solche Färbesequenzen ermöglichen. Die traditionelle visuelle oder quantitative Erfassung der Inhalte von Auswertefenstern in zwei- oder dreidimensionalen zytometrischen Histogrammen sammeln nur eine sehr begrenzte Menge der verfügbaren Information, und es ist dabei niemals sicher, ob die wirklich wichtige Information überhaupt erfaßt wurde. Zusätzlich zeigt die Erfahrung, daß es nicht einfach ist, qualitätskontrollierte Konsensusstrategien für die Multiparameterdatenanalyse zu entwickeln. Außerdem gibt es wenig Interpretationswissen über sehr komplexe zytometrische Vielparameterdatenräume. Wesentliche Information kann deshalb einfach durch einen Mangel an Bewußtsein über deren Existenz verlorengehen.
Dabei ist es z.B. empirisch ratsam, für durchflußzytometrisch durch Vorwärts- (FSC) und Seitwärtslichtstreuung (SSC) oder typische Antigenexpression z.B. CD45 eindeutig charakterisierte Zellpopulationen, wie Lympho-, Mono- oder Granulozyten, selbsteinstellende, sich nahtlos berührende Auswertefenster für die automatische Analyse zu benutzen. Die anschließende Bestimmung weiterer Eigenschaften dieser Zellpopulationen bezüglich der Expression Fluoreszenz-gefärbter Eigenschaftsmuster in den jeweils durch Projektion ermittelten Zweiparameterhistogrammen kann durch Quadrantenanalyse mit feststehenden Grenzen ebenfalls automatisiert werden. Hierbei ist es nicht von vorrangiger Bedeutung, daß eventuelle Zellpopulationsgrenzen genau respektiert werden, da relevante Informationen in der nachfolgenden Datensiebung zur Ermittlung der diskriminantesten Datenmuster in jedem Falle erfaßt werden, vorausgesetzt die Information von mehr als 95% aller Zellen wurde während der Phase der Informationssammlung eingebracht.
Die Datensiebung als alternative nicht-statistische Wissensextraktionsstrategie erfordert keine mathematischen Annahmen über Werteverteilungen, fehlende Experimentalwerte müssen nicht ergänzt werden, die Analyse ist für Parallelprozessierung geeignet und inhärent schnell, da nur Schwellwertvergleiche zur Klassifizierung erforderlich sind.
Wenn Referenzgruppen desselben Typs in verschiedenen Laboratorien vermessen werden, sind sie bei Klassifizierung gegeneinander nicht voneinander unterscheidbar, vorausgesetzt sie sind aus repräsentativen Referenzpersonen oder Proben zusammengesetzt und mit Langzeitpräzision und spezifischen Reagenzien vermessen worden. Referenzgruppen können durch Konsensus definiert werden. Auf diese Weise ist eine standardisierte und laborunabhängige Klassifizierung relationaler Daten möglich und relationale Datenbanken aus verschiedenen Labors können in größeren Datenbanken zusammengeführt werden. Ergeben sich bei der Klassifizierzung Unterschiede zwischen korrekt zusammengesetzten Referenzgruppen aus verschiedenen Labors, so ist dies ein Anzeichen für methodische oder ethnische Unterschiede.
Auf diese Weise kann ein relationales System zur objektiven molekularen Beschreibung von Krankheiten oder von elementaren Zellzuständen wie Differenzierung, Reifung, Teilung oder Malignität auf Zellniveau erstellt werden. Verschiedene Zelltypen stehen in einer standardisierten Bezug zueinander in einer Art periodischem System der Zellen.
Auf der ersten Ebene wird das Zellverhalten im Lebenszyklus angesprochen unter Einschluß von Zellzykluskontrolle, Biomolekülsynthese, Molekülimport und Export, Energie- und oxido-reduktive Bilanz sowie Organellenfunktion um nur einige wichtige Phänomene anzusprechnen. Es erscheint ebenfalls wichtig, die signifikante Dispersion vieler Zellpopulationsparameter im Bereich zwischen 1:10 bis zu 1:10.000 anzusprechen, wie sie durch die Variationskoeffizienten ihrer Werteverteilungen angezeigt wird. Die multiparametrische Heterogenität von Zellen in ihrer kombinatorischen Multiplizität kann von hoher Bedeutung für die zuverlässige Anpassung von Zellen an neue Umgebungsbedingungen und für die Empfänglichkeit oder Resistenz gegenüber Krankheiten oder Therapie sein.
Auf der zweiten Ebene werden Einzelzellpräparationen entweder wie gesammelt oder nach mechanischer bzw. enzymatischer Aufarbeitung mittels Durchfluß- oder Bildzytometrie untersucht, um den Molekularstatus normaler oder kranker Zellen als Deskriptoren für Gesundheit und Krankheit zu bestimmen. Diese Unterscheidung hängt nicht notwendigerweise von der originalen in-situ Anordnung det Zellen im Gewebe ab, wenn die Schlußfolgerungen aus dem Molekularstatus spezifischer Zellen oder Zellkombinationen gezogen werden.
Die dritte Ebene betrifft Zellen in assemblierten Geweben. Hierbei können die molekularen Zwischenbeziehungen und die Nähe der Zellen bei Gesundheit oder Krankheit innerhalb einer intakter Zellarchitektur und unter den komplexesten Bedingungen auf höchstem Organisationsniveau untersucht werden.
- Das notwendigte Wissen kann durch eine vielschichtige molekulare Einzelzellanalyse nahe an den in-vivo Bedingungen im Zusammenhang mit einer erschöpfenden bioinformatischen Wissensextraktion (Zytomik) gewonnen werden.
- Die Untersuchungsresultate werden in ein relationalen Wissenssystem oder Rahmenwerk eingebracht und stehen für die wissenschaftliche Hypothesenbildung, ebenso wie für direkt Medizin-bezogene Verwendungen, wie Prädiktivmedizin mittels Zytomik d.h. Vorhersagen über den Therapie-abhängigen zukünftigen Krankheitsverlauf beim Einzelpatienten sowie personalisierte Therapiemöglichkeiten und die Suche nach neuen pharmazeutischen Zielmolekülen zur Verfügung.
- Die Einrichtung eines derartigen relationalen Wissenssystems bei gleichzeitiger Weiterentwicklung Einzelzell-orientierter instrumenteller Untersuchungstechniken sowie empfindlicher Biomolekülmarkierungen in einem Humanzytomprojekt stellt eine für verschiedenste Bereich der Bioforschung vielversprechende Herausforderung an Wissenschaft, Medizin und Technologieinnovation dar.
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